De Hong-Kong Chinees Dennis Lo en medewerkers waren in 1997 de eersten die de aanwezigheid van niet celgebonden DNA in het maternaal plasma en serum aantoonden. Zij detecteerden met behulp van real-time kwantitatieve polymerase ketting reacties (RQ-PCR) de Y-chromosoom specifieke SRY sequentie in het plasma en serum van vrouwen die zwanger waren van een jongetje. De concentraties van dit niet celgebonden foetus specifieke DNA in het maternale plasma en serum zijn relatief hoog, en nemen tijdens de zwangerschap gradueel toe met een sterke stijging in de laatste 10 weken van graviditeit. Aan het einde van het eerste trimester van de zwangerschap is de foetale DNA concentratie ongeveer 200 pg/ml. Dit komt overeen met het DNA van 30 cellen, ook wel 30 “genoom equivalenten” genoemd. Deze concentraties zijn veel hoger dan die van intacte foetale cellen in de moederlijke circulatie. Niet celgebonden foetaal DNA wordt postpartum zeer snel geklaard, dit in tegenstelling tot intacte foetale cellen die soms jaren postpartum nog kunnen blijven circuleren in het moederlijke bloed en, mede daardoor, het gebruik voor prenataal diagnostische doeleinden ernstig belemmeren.
Niet celgebonden foetaal DNA komt waarschijnlijk vrij uit gelyseerde trophoblastcellen ter plaatse van de foeto-maternale eenheid. Om het celvrije foetale DNA te kunnen herkennen in de overmaat van niet celgebonden moederlijk DNA, is het noodzakelijk om één of meer sequenties te vermenigvuldigen die voorkomen in het foetale, maar niet in het maternale genoom. Recentelijk rapporteerden Costa et al. de succesvolle amplificatie van foetale mRNA sequenties. Met behulp van RQ-PCR detecteerden zij ßHCG mRNA in eerste en tweede trimester sera van zwangere vrouwen.

Sinds de eerste publicatie van Lo et al. in 1997, zijn diverse klinische toepassingen van celvrij foetale DNA detectie in het maternale plasma beschreven (hoofdstuk 2). Deze toepassingen kunnen in twee groepen verdeeld worden.
De eerste groep van toepassingen is de detectie van foetale sequenties van paternale origine voor foetale geslachtsbepaling, de bepaling van de foetale RhD status of het aantonen van paternale monogenetische gen afwijkingen. Tevens kunnen deze gensequenties gebruikt worden als interne controle om het vermogen van de test om foetaal DNA te amplificeren te controleren. In de literatuur beschreven zeven groepen hun resultaten van niet-invasieve foetale geslachtsbepaling in maternaal plasma of serum met in totaal 767 samples tussen de 5 en 41 weken zwangerschapsduur. In deze heterogene groep werd een sensitiviteit van 95,8% bereikt (95% betrouwbaarheids interval 93,2-97,6%). Niet-invasieve foetale RhD genotypering, laat in de literatuur ook veelbelovende resultaten zien. Vijf verschillende groepen hebben in totaal 356 samples tussen de 15 en 17 weken zwangerschapsduur geanalyseerd. Slechts in 5 gevallen werd een fout negatief resultaat verkregen en in 4 gevallen een fout positief resultaat. Tenslotte zijn er diverse case reports verschenen waarin paternale genen gedetecteerd werden in het maternale plasma voor de prenatale diagnose van achondroplasie, myotone dystrofie, mucoviscoidosis en de ziekte van Huntington.
De tweede groep van toepassingen voor niet celgebonden foetaal DNA in maternaal plasma maakt gebruik van de gevonden concentraties. Kleinschalige studies beschreven hogere concentraties celvrij foetaal DNA in de maternale circulatie bij (dreigende) partus prematurus, preeclampsie en aneuploidieën. Grootschaliger onderzoek is nodig om de klinische waarde van deze bevindingen te evalueren.

De studie beschreven in hoofdstuk 3 werd verricht naar aanleiding van een recente publicatie van Invernizzi en medewerkers waarin gesuggereerd werd dat niet celgebonden foetaal DNA jaren postpartum nog gedetecteerd kan worden in het moederlijke plasma. Het persisteren van foetaal DNA na de bevalling zou een ernstige belemmering vormen voor de toepassing van de techniek ten behoeve van prenatale diagnostiek. Wij voerden een onderzoek uit bij 120 niet-zwangere vrouwen van wie er 64 in het verleden één of meer zonen hadden gebaard. In geen van de 192 RQ-PCR’s op DNA geïsoleerd uit het plasma van de laatstgenoemde 64 vrouwen werd het Y chromosoom specifieke SRY gen geamplificeerd. Ook in het plasma van de overige 56 vrouwen werden geen SRY sequenties gedetecteerd. Onze resultaten zijn geheel concordant met de resultaten van twee andere groepen die soortgelijke experimenten uitvoerden en het plausibel maakten dat de langzame centrifugering van het plasma (en/of het achterwege laten van filtratie) door Invernizzi et al. verantwoordelijk was voor de door hen aangetroffen foetale DNA sequenties. Apoptotische foetale cellen in de celfractie van het plasma, waarvan bekend is dat ze kunnen persisteren na de bevalling, zouden verantwoordelijk zijn voor de “fout positieve” resultaten van Invernizzi en coauteurs. Wij concluderen dat er geen bewijs is dat niet celgebonden foetaal DNA aanwezig is in goed gecentrifugeerd plasma van niet zwangere vrouwen in zodanige concentraties dat het betrouwbare foetale genotypering in de weg zou staan.

In hoofdstuk 4 wordt onderzoek beschreven dat evalueert vanaf welke zwangerschapsduur de detectie van celvrij foetaal DNA voor foetale geslachtbepaling betrouwbaar is. Bij 17 vrouwen zwanger na in vitro fertilisatie (IVF) of intrauterine inseminatie (IUI) werden gedurende het eerste trimester van de zwangerschap meerdere bloedmonsters afgenomen. Na het isoleren van het DNA uit het plasma werd getracht het Y chromosoom specifieke SRY gen te amplificeren middels RQ-PCR. Om de RQ-PCR van het SRY gen te valideren werd hetzelfde gedaan bij 31 vrouwen voorafgaand aan een vruchtwaterpunctie. Alle test resultaten werden vergeleken met het cytogenetische geslacht en/of het geslacht van het kind na de geboorte. De vroegste SRY detectie was bij een zwangerschapsduur van 5 weken en 2 dagen. In geen van de 4 zwangerschappen die eindigden in een miskraam werd SRY geïsoleerd. We detecteerden SRY sequenties bij 1 van de 2 vrouwen (50%) die een mannelijke foetus droegen bij een zwangerschapsduur van 5 weken, bij 4 van de 5 vrouwen (80%) bij een zwangerschapsduur van 7 weken en bij 4 van de 4 vrouwen (100%) bij een zwangerschapsduur van 9 weken. In alle 7 vrouwen zwanger van een jongetje werd het correcte geslacht voorspeld bij een zwangerschapsduur van 10 weken. Er waren geen fout positieve resultaten. In de validatiegroep werd bij alle 13 vrouwen zwanger van een jongetje SRY in het plasma aangetoond en bij geen van de 18 vrouwen zwanger van een meisje.
We concluderen dat RQ-PCR van het SRY gen in het maternale plasma zeer waarschijnlijk een betrouwbare methode is voor niet-invasieve foetale geslachtbepaling in het eerste trimester van de zwangerschap. De aantallen in onze studie zijn echter te klein om betrouwbaar de sensitiviteit van de techniek voor de jonge zwangerschap te bepalen.

In hoofdstuk 5 wordt een overzicht gegeven van de recente ontwikkelingen op het gebied van prenatale bloedgroep typering. We beperken ons tot de Rh- en Kell-systemen, die samen verantwoordelijk zijn voor meer dan 85% van alle bij zwangere vrouwen gevonden irregulaire antistoffen en verantwoordelijk zijn voor vrijwel alle gevallen van hemolytische ziekte van de pasgeborene.
De ontrafeling van de moleculaire basis van de bloedgroep systemen heeft het mogelijk gemaakt te genotyperen met behulp van PCR. Zo is het mogelijk de zygositeit van de vader te bepalen. Tevens kunnen de PCR assays ingezet worden op foetaal DNA dat op invasieve wijze (vlokkentest, vruchtwaterpunctie), maar ook op niet-invasieve wijze (intacte foetale cellen of celvrij foetaal DNA uit moederlijk bloed) wordt verkregen.
Het is belangrijk om te realiseren dat de resultaten van genotypering niet altijd concordant zijn met serologische uitslagen. Sommige RHD allelen resulteren niet in RhD positieve serologie, zoals bij het RHD pseudo-gen (RHDf). Dit pseudo-gen is zeldzaam bij mensen van het kaukasische ras maar komt bij ongeveer 7 procent van de negroïde mensen voor. Bij het RHD pseudo-gen is er een partiele deletie die resulteert in een RhD negatief fenotype. Wij beschreven eerder een multiplex PCR waarin gelijktijdig alle RHD specifieke coderende exonen worden geamplificeerd in 1 enkel reageerbuisje. In deze multiplex PCR worden de meeste aberrante RHD allelen herkent. RQ-PCR’s ter amplificatie van niet celgebonden foetale RHD sequenties in het maternale bloed laten veelbelovende resultaten zien. De sensitiviteit en specificiteit zijn echter niet 100% zodat deze methode vooralsnog alleen klinisch toegepast kan worden voor de screening van RhD negatieve vrouwen in het derde trimester van de zwangerschap om tot een meer gerichte en kosteneffectievere antenatale anti-D immunoprofylaxe toediening te komen.

In hoofdstuk zes wordt de ontwikkeling van een interne controle voor de amplificatie van celvrij foetaal DNA uit moederlijk plasma beschreven. Een dergelijke controle waarin aangetoond wordt of er daadwerkelijk foetaal DNA wordt geamplificeerd tijdens een RQ-PCR zou de specificiteit van de test moeten doen maximaliseren. Dit is in het bijzonder belangrijk in die gevallen waarin er geen andere bevestigingsmethode voorhanden is om het testresultaat te evalueren (zoals echo diagnostiek bij foetale geslachtsbepaling). De PCR’s gebruikt in ons onderzoek zijn allel specifiek voor 10 bi-allelische insertie/deletie polymorphismen. We tonen aan dat de specificiteit en sensitiviteit van de PCR’s het mogelijk maakt om één enkele foetale DNA sequentie te detecteren in een achtergrond van een grote hoeveelheid maternaal DNA. Uit de geobserveerde distributie van de verschillende allelen bij 280 kaukasische personen berekende we dat met de door ons gebruikte set van polymorhismen in ongeveer 95% van de zwangerschappen minstens 1 informatief allel aanwezig zou moeten zijn. Onze benadering werd toegepast in 20 zwangerschappen. Bij 13 paren bleek de vader homozygoot positief voor een marker waarvoor de moeder negatief was. Het gemiddelde aantal van mogelijk informatieve allelen was 3,1 (range 1-5). Het gemiddelde aantal informatieve allelen na de geboorte was 2,35 (range 1-3). Alle 20 maternale plasmamonsters (gemiddelde amenorhoe 20 weken, range 15-30 weken) werden getest in verschillende PQ-PCR assays, inclusief die met mogelijke informatieve allelen. De resultaten van 80 verschillende PCR’s op maternaal plasma werden vergeleken met de genotyperings resultaten van DNA verkregen uit het wangslijmvlies van de 20 pasgeborenen. Alle uitslagen waren concordant. Zowel de positief als negatief voorspellende waarde van de test waren 100% (95% betrouwbaarheidsintervallen respectievelijk 91.0-100% en 95-100%). Tevens is gebleken dat de test relatief makkelijk uit te voeren is en makkelijk te implementeren is in diagnostische niet-invasieve prenatale geotyperings assays.

In hoofdstuk 7 beschrijven we het gebruik van een RQ-PCR voor de detectie van het SRY gen ten behoeve van een vroege foetale geslachtsbepaling om onnodig lange dexamethason therapie en invasieve prenatale diagnostiek te voorkomen bij vrouwen die zwanger zijn van een foetus met een verhoogd risico op adrenogenitaal syndroom (AGS). Tegelijkertijd voerden we dezelfde test uit bij 25 en 19 vrouwen in het eerste respectievelijk tweede trimester van hun zwangerschap en vergeleken de “plasma resultaten” met het foetale geslacht uit vlokken of vruchtwater of het geslacht van het kind na de partus. De index patiënte was een 34-jarige vrouw wier vorige dochter geviriliseerd was ten gevolge van AGS. Ondanks uitgebreide preconceptionele counseling meldde patiënte zich pas voor het eerst op de polikliniek bij een zwangerschapsduur van 13 ½ weken. Echoscopisch onderzoek wees uit dat er sprake was van een jongetje dan wel een geviriliseerd meisje. De patiënte weigerde invasieve prenatale diagnostiek en dexamethason therapie. Er werden drie bloed monsters van de patiënte geanalyseerd: het eerste monster was het spijtserum dat afgenomen werd bij het eerste consult, de twee andere waren plasma monsters afgenomen bij respectievelijk 27 en 31 weken zwangerschapsduur. In alle drie de monsters werd middels RQ-PCR foetaal SRY gedetecteerd. Bij een zwangerschapsduur van 37½ weken beviel patiënt spontaan vaginaal van een gezond jomgetje met een normaal serum 17a-hydroxylase wat AGS uitsluit. In alle 26 eerste trimester plasma monsters op één na werd het juiste foetale geslacht voorspeld (11 vrouwelijk en 14 mannelijk). Eén uitslag werd als niet conclusief afgegeven. Dit betekend een correcte voorspelling in 96,2% van de zwangerschappen (95% betrouwbaarheidsinterval 80,4-99,9%). In de monsters afgenomen in het tweede trimester van de zwangerschap werd het geslacht van alle 10 meisjes en 9 jongens correct voorspeld (100%, 95% betrouwbaarheidsinterval 82,4-100%). In totaal werd bij 97,8% van de foetus het geslacht correct voorspeld (95% betrouwbaarheidsinterval 88,2-99.9%).
In deze studie toonden wij aan dat foetale geslachtsbepaling in het maternale plasma betrouwbaar is en derhalve een vlokkentest achterwege gelaten kan worden wanneer uit de plasma analyse blijkt dat de foetus mannelijk is. Tevens kan in deze groep de dexamethason therapy gestopt worden. We ontwikkelden een protocol waarin voorgesteld wordt te starten met dexamethason therapie bij 5 weken zwangerschapsduur. Tegelijkertijd kan wekelijks een bloedafname verricht worden ten behoeve van de foetale geslachtsbepaling in het maternale plasma tot een zwangerschapsduur van 11 weken, of totdat mannelijk DNA gedetecteerd wordt in het plasma. In het geval van een mannelijke foetus kan de dexamethason therapie gestaakt worden en is een vlokkentest niet nodig. Zolang er geen mannelijk DNA gedetecteerd wordt dient de medicatie gehandhaafd te blijven tenzij analyse van chorionvlokken aantoont dat er sprake is van een niet aangedane vrouwelijke foetus.
Geprikkeld door onze eerste klinische toepassing van celvrij foetale DNA detectie in het moederlijke plasma zoals hierboven beschreven, werd een validatiestudie verricht voor RQ-PCR’s voor de detectie van RHD en SRY in plasmamonsters die afgenomen werden bij zwangere vrouwen voordat zij invasieve prenatale diagnostiek ondergingen. Deze studie wordt beschreven in hoofdstuk 8. In totaal werden 72 monsters (van 72 vrouwen) geanalyseerd. De sensitiviteit van de RHD PCR in maternaal plasma was 100% (95% betrouwbaarheidsinterval 91,8-100%), de specificiteit was 96,6% (95% betrouwbaarheidsinterval 82,2-99,9%). De sensitiviteit van de SRY PCR was in deze groep 97,2% (95% betrouwbaarheidsinterval 85,5-99,9%), de specificiteit was 100% (95% betrouwbaarheidsinterval 88,1-100%). Deze veelbelovende resultaten noopten ons tot het aanbieden van de test in een klinische setting aan 24 patiënten van wie er 15 draagsters waren van een geslachtsoverervende recessieve aandoening en 4 zwanger waren van een foetus met een verhoogd risico op AGS. Verder werd de test aangeboden aan 3 RhD negatieve zwangere vrouwen met RhD antistoffen en aan twee vrouwen voor andere redenen. In deze patiëntengroep werden geen fout positieve of fout negatieve resultaten gevonden. In 41,7% van deze patiënten kon invasieve prenatale diagnostiek worden voorkomen.
We concluderen dat celvrij foetale DNA detectie in moederlijk plasma een hoge sensitiviteit en specificiteit heeft. In gevallen van geslachtsoverervende recessieve aandoeningen kan de nieuwe techniek leiden tot een 50% reductie van invasieve prenatale diagnostiek. Bij foetus met een verhoogd risico op AGS kan de techniek leiden tot een 50% reductie van invasieve prenatale diagnostiek en een substantiële verkorting van maternaal dexamethason gebruik. Bij zwangerschappen van RhD negatieve vrouwen met RhD antistoffen en een heterozygote partner kan intensieve invasieve en echoscopische monitoring van de foetus op tekenen van anaemie wellicht achterwege gelaten worden wanneer de plasma RHD PCR negatief is maar wel paternale allelen in het moederlijke plasma aangetoond worden. Toekomstig onderzoek zal dit moeten uitwijzen.
In hoofdstuk 9 worden de ethische implicaties van niet-invasieve foetale geslachtbepaling in de vroege zwangerschap besproken. Het doel was te onderzoeken of deze techniek, ook in het licht van de recente mogelijkheden tot medicamenteuze abortus provocatus, nieuwe gezichtpunten oplevert op de inhoud en conclusies van een in 1995 verschenen rapport van de Gezondheidsraad over sekse selectie op niet medische redenen (Sex selection for non medical reasons). Wij stellen voor sociologisch en epidemiologisch onderzoek te verrichten naar de actuele attitude en praktijk op dit gebied. De resultaten van dit onderzoek zouden vervolgens de ethische discussie kunnen voeden. De mogelijkheid van eventuele commerciële beschikbaarheid van de nieuwe techniek roept de vraag op wat de legale status is van foetaal DNA in maternaal bloed, valt dit onder foetaal weefsel zoals omschreven in de Embryowet? Wij adviseren een verdere discussie betreffende dit onderwerp door de wetgever.“