Corticostero?den zijn stero?dhormonen die betrokken zijn bij veel fysiologische processen zoals stressrespons, immuunrespons, regulatie van ontstekingsprocessen, eitwitcatabolisme en zouthomeostase. Er zijn twee groepen corticostero?den, de mineralocortico?den, die een belangrijke rol spelen bij het reguleren van mineraalconcentraties en de glucocorticoïden. Glucocorticoïden zijn betrokken bij veel fysiologische processen in het gehele lichaam en zijn essentieel voor de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel. Deze stero?dhormonen oefenen hun functie uit door te binden aan intracellulaire steroïdreceptoren, de glucocortico?d receptor (GR) en de mineralocortico?d receptor (MR). Als deze receptoren bezet zijn, functioneren ze als transcriptiefactoren en kunnen de expressie van specifieke genen moduleren. De GR en de MR zijn in hoge concentratie aanwezig in de hippocampus, een hersenstructuur die betrokken is bij processen zoals gedrag, leren en geheugen.Door de vele functies van glucocorticoïden in het lichaam, behoren synthetische analoga tot de meest gebruikte geneesmiddelen. De synthetische glucocorticoïden, dexamethason en betamethason, worden tijdens de zwangerschap gebruikt wanneer vrouwen vroegtijdig dreigen te bevallen. Deze behandeling is noodzakelijk om de longrijping van de foetus te stimuleren. Hoewel deze vaak toegepaste antenatale glucocortico?dbehandeling de kans op overleven sterk vergroot, bestaat er nog steeds onduidelijkheid over de mogelijke ongewenste bijwerkingen van deze krachtige middelen. Normaal wordt de foetus tegen de relatief hoge moederlijke fysiologische steroïden beschermd door de placenta, die deze slechts beperkt doorlaat. Synthetische glucocorticoïden passeren de placenta wel gemakkelijk en kunnen ook eenvoudig in de hersenen terecht komen, omdat de bloed-hersenbarrière nog niet volledig ontwikkeld is.

Het doel van het in dit proefschrift beschreven onderzoek was om mogelijke ongunstige bijwerkingen van een eenmalige glucocortico?dbehandeling op de ontwikkelende foetus op te helderen. In dit proefschrift hebben we ons gericht op de placenta en de hippocampus van de ontwikkelende foetus. In de humane placenta hebben we het glutamaatmetabolisme bestudeerd, waarvan bekend is dat het een belangrijke rol speelt in de foetale groei en ontwikkeling. De placenta speelt een belangrijke rol in het reguleren van de hoeveelheid glutamaat dat circuleert in de foetus. Een te hoge glutamaat concentratie in de hersenen kan leiden tot neurotoxiciteit. In de foetale hersenen is de hippocampus bijzonder gevoelig voor hoge concentraties synthetische glucocorticoïden. Daarom werden in een muizenmodel de potentiële bijwerkingen van antenatale glucocorticoïdbehandeling op de hippocampusontwikkeling bestudeerd, waarbij een toedieningsprotocol werd gebruikt vergelijkbaar met het protocol bij de mens.
 
In hoofdstuk 2 en 3 zijn het glutamaatmetabolisme in de humane placenta en de effecten van antenatale dexamethasonbehandeling daarop onderzocht. De placenta speelt en belangrijke rol in het reguleren van de hoeveelheid glutamaat door het uit de foetale circulatie te verwijderen. Het onderliggende mechanisme voor het uitwisselen van glutamaat tussen moeder en foetus is grotendeels onbekend, maar glutamaattransporters en het enzym glutamine synthetase zijn mogelijk betrokken bij deze processen.
 
In hoofdstuk 2 beschrijven we de lokalisatie van drie glutamaattransporters, EAAT1, EAAT2 en EAAT3 in de humane placenta in verschillende periodes van de zwangerschap. Immunohistochemische kleuringen toonden een duidelijke celspecifieke expressie van de drie glutamaattransporter eiwitten. EAAT1 kwam tot expressie in het syncytiotrofoblast, de cellaag die grenst aan de maternale circulatie. EAAT2 werd gevonden in het syncytiotrofoblast en op het endotheel van sommige bloedvaten. Deze endotheliale cellaag is gelegen tussen de foetale circulatie en de placenta. EAAT3 kwam voornamelijk tot expressie in het endotheel van de foetale bloedvaten. De lokalisatie van glutamaat transporters in de placenta suggereert dat EAATs een belangrijke functie hebben bij het glutamaat transport gedurende de foetale ontwikkeling.
 
In hoofdstuk 3 hebben we ons gericht op glutamine synthetase (GS), een enzym dat glutamaat omzet in glutamine. Glutamine is een niet-essentieel aminozuur dat een bron van energie is voor de nucleotide synthese in alle frequent delende cellen. In de humane placenta kwamen GS mRNA en eiwit tot expressie in het syncytiotrofoblast en in de stromacellen. We hebben ook het effect van antenatale glucocorticoïdbehandeling op de GS distributie en expressie onderzocht. Omdat GS een glucocorticoïd respons element bevat, verwachtten we regulatie door glucocorticoïden. Echter, er werden na antenatale glucocorticoïdbehandeling geen verschillen in GS mRNA en eiwitexpressie gevonden. Onze gegevens tonen aan dat antenatale glucocorticoïdbehandeling geen effect heeft op de distributie van GS, maar kwantitatief onderzoek is nodig om het effect van glucocortico?den op GS expressie op te helderen. Het expressie patroon van GS samen met die van de EAATs in de humane placenta suggereren een specifieke functie in de glutamaat uitwisseling tussen moeder en foetus.
De werking van glucocorticoïden wordt gemedieerd door de binding aan twee receptoren, de GR en MR, die uitgebreid tot expressie komen in de hippocampus.
 
In hoofdstuk 4 hebben we de ontogenese van de GR en MR in de hippocampus van mens en muis onderzocht, in relatie tot antenatale glucocortico?dbehandeling. In de kliniek worden glucocorticoïden tussen 24 en 34 weken van de zwangerschapsduur gegeven aan vrouwen die vroegtijdig dreigen te bevallen. In het muizenmodel dat wij gebruikt hebben, werden de glucocorticoïden toegediend bij een zwangerschapsduur van 15.5 dagen (E15.5), een zwangerschapsduur die qua foetale hippocampale ontwikkeling vergelijkbaar is met de situatie in de mens. De ontogenese van GR en MR expressie werd onderzocht in de humane hippocampus tussen 24 tot 34 weken zwangerschapsduur, en in de muizenhippocampus vanaf E14.5. Tevens werden de effecten van antenatale glucocortico?den op het expressieniveau van de receptoren onderzocht. In de muizenhippocampus werd MR mRNA voor het eerst gevonden op E15.5, terwijl GR mRNA pas aanwezig was 5 dagen na de geboorte (P5). Aangezien GR mRNA expressie niet aantoonbaar was op P1, wordt GR expressie geïnduceerd tussen P1 en P5. Deze gegevens suggereren dat de werking van antenataal toegediende glucocorticoïden in de muis gemedieerd wordt door de MR. Daarentegen komen in de hippocampus van de mens zowel de GR als MR tot expressie vanaf 24 weken zwangerschapsduur. De ontogenese van GR verschilt daarmee tussen mens en muis. Of de effecten van glucocorticocden bij de mens gemedieerd worden door GR en/of door MR moet nog worden vastgesteld. Kwantitatieve in situ hybridisatie in de muis wees uit dat direct na glucocorticoïdtoediening MR mRNA hoeveelheden waren afgenomen, terwijl op E18 geen effect meer werd waargenomen. Antenatale glucocorticoïdbehandeling op E15.5 beïnvloedt dus tijdelijk de MR mRNA hoeveelheid in de hippocampus van de muis. In de humane hippocampus werd geen effect van antenatale glucocortico?dbehandeling gevonden op GR en MR mRNA. Dus op het tijdstip van glucocorticoïdtoediening komen zowel de GR als MR tot expressie komen in de hippocampus van de mens, terwijl alleen de MR tot expressie komt in de hippocampus van de muis. Daarom kan dit muizenmodel wellicht worden gebruikt om de effecten van glucocorticoiden op de hippocampus ontwikkeling te bestuderen die gemedieerd worden door de MR, zonder dat er sprake is van eventuele interferentie van de GR.
 
Hoofdstuk 5 richt zich op de effecten van een eenmalige antenatale glucocortico?dtoediening op de ontwikkeling van de hippocampus van de muis. We hebben de effecten van dexamethason onderzocht op lichaamsgewicht, het volume van de hippocampus en het aantal neuronen in de CA en DG van de hippocampus op E16, E18, P0, P5, P10, P20 en op de leeftijd van zes maanden (volwassen stadium). Tevens werd het aantal apoptotische cellen (afstervend door geprogrammeerde celdood) in de hippocampus en het aantal delende cellen in de subgranulaire zone van de DG (hier vindt de meeste neurogenese plaats) bepaald. Lichaamsgewicht, hippocampusvolume en het aantal neuronen in de hippocampus waren lager na antenatale toediening van dexamethason; maar deze effecten waren slecht tijdelijk. Kort na dexamethasontoediening was het aantal apoptotische cellen in de CA en DG van de hippocampus toegenomen. Vanaf P5 was dit effect afwezig. Gelijktijdig met de toegenomen apoptose, was de celdeling in de subgranulaire zone van de DG afgenomen. Het aantal delende cellen in de subgranulaire zone was vervolgens toegenomen op P5 en P10, en weer lager in het volwassen dier. Dus antenatale dexamethasonbehandeling resulteert in een tijdelijk effect op lichaamsgewicht, hippocampusvolume, het aantal neuronen en apoptose in de hippocampus. Het enige lange-termijn effect dat gevonden werd, was een afname van het aantal delende cellen.
Omdat we lange-termijn effecten vonden na antenatale dexamethasonebehandeling op het aantal delende cellen in de hippocampus, hebben we de effecten op volwassen leeftijd meer gedetailleerd onderzocht.
 
In hoofdstuk 6 hebben we de effecten van antenatale dexamethasonbehandeling op het leergedrag van de volwassen muis onderzocht. Leren is afhankelijk van de functie van de hippocampus en kan bestudeerd worden met behulp van de “Morris water maze”. Om de plasticiteit van de hippocampus te onderzoeken, hebben we elektrofysiologische experimenten uitgevoerd, waarbij de mate van LTP en LTD inductie in de volwassen hippocampus werd bepaald. Deze synaptisch processen worden geinitieerd door activatie van NMDA glutamaat receptoren, die elk zijn opgebouwd uit verschillende subunits. Omdat het bekend is dat de NMDAa receptor subunitsamenstelling involed heeft op synaptische plasticiteit, hebben we de hoeveelheden mRNA van de NMDA receptor subunits NR1, NR2A en NR2B gemeten in het CA1 gebied van de volwassen hippocampus. Verder is een histologische analyse uitgevoerd op de lever en het hart van de volwassen muis, omdat in deze organen hoge aantallen corticostero?dreceptoren aanwezig zijn op het tijdstip dat dexamethason werd toegediend. Antenataal behandelde muizen hadden meer moeite met het vinden van een platvorm net onder de waterspiegel, ondanks het feit dat spieractiviteit, motivatie en gezichtsvermogen onveranderd waren. Elektrofysiologische experimenten demonstreerden een significant verstoorde LTD inductie in het CA1 gebied van de hippocampus, terwijl LTP inductie niet was veranderd. Verder was de mRNA expressie van de NMDA receptor subunit NR2B, die betrokken is in LTD, afgenomen in het CA1 gebied van de volwassen hippocampus van de met dexamethason behandelde muizen. Daarentegen waren de NR1 en NR2A subunit mRNA expressie niet veranderd in het CA1 gebied. Histopathologische analyse van het volwassen hart en de volwassen lever liet toegenomen fibrose zien na antenatale dexamethasonbehandeling. In het hart werd interstitieel fibrose waargenomen, terwijl er geen veranderde spiercelorganisatie zichtbaar was. In de lever was fibrotisch weefsel aanwezig rond de centrale vene, met geringe uitbreiding naar de portale driehoek. Geconcludeerd kan worden dat antenatale dexamethason behandeling bij muizen resulteert in lange-termijn moleculaire veranderingen, leerstoornissen, verstoorde synaptische plasticiteit en histologische veranderingen in lever en hart. Interessant genoeg komen deze moleculaire en functionele lange-termijn veranderingen ook voor bij het normale verouderingsproces, wat wijst op een mogelijk effect van antenatale glucocorticoïdbehandeling op dit proces.
Het is niet bekend of voor de geboorte toegediende corticosteroïden bij de mens leiden tot een versnelde veroudering op latere leeftijd, omdat (de schaarse) follow-up studies nog maar de jong-volwassen leeftijd hebben bereikt. Vanwege de potentiële implicaties van onze experimentele bevindingen is het van belang om glucocorticoïdbehandelingen zo weinig mogelijk toe te passen. Betere identificatie van vrouwen met een verhoogd risico op vroeggeboorte is noodzakelijk en bepaling van de foetale longrijping in vruchtwater kan niet noodzakelijke behandelingen voorkomen. Tevens is onderzoek naar alternatieve behandelingen noodzakelijk, zoals behandeling met methylprednisolon en hydrocortison, synthetische corticosteroïden die waarschijnlijk minder bijwerkingen hebben. Tot slot is onderzoek nodig naar longrijpingsbevorderende medicatie, die uitsluitend op de longrijping werkt en niet op andere orgaansystemen. Zolang de veiligheid van de huidige antenatale corticosteroïdbehandeling bij de mens op de lange termijn nog niet is vastgesteld, dient men uiterst voorzichtig te zijn met het gebruik van deze middelen.