Pre-eclampsie is een ernstige complicatie van de zwangerschap en wereldwijd één van de belangrijkste oorzaken van maternale en perinatale morbiditeit en mortaliteit. Endotheel- en trophoblastceldysfunctie spelen een cruciale rol in de pathophysiologie van pre-eclampsie. In dit proefschrift zijn pathofysiologische mechanismen en moleculaire profielen van endotheel- en trophoblastceldysfunctie bij ernstige, vroeg-ontstane pre-eclampsie onderzocht.

Hoofdstuk 1
Deel A. De inleiding van dit proefschrift begint met een beschrijving van de klinische karakteristieken en pathofysiologische mechanismen van pre-eclampsie. Bij ernstige, vroeg-ontstane pre-eclampsie, ook wel placentaire pre-eclampsie genoemd, ontstaan het syndroom vanuit een gehypoperfundeerde en hypoxische placenta. De leidende hypothese stelt dat maternale systemische endotheeldysfunctie veroorzaakt wordt door circulerende factoren welke vrijkomen vanuit de hypoxische placenta. Gegeneraliseerde endotheeldysfunctie wordt als vooraanstaande component binnen het maternale systemische inflammatoire syndroom beschouwd, en de meerderheid van de klinische verschijnselen bij pre-eclampsie wordt aan endotheeldysfunctie toegedacht. Alhoewel uitgebreid bewijs de aanwezigheid van endotheeldysfunctie bij pre-eclampsie suggereert, zijn de onderliggende mechanismen en het moleculair profiel alsook de lokalisatie van endotheeldysfunctie in vivo nog niet opgehelderd.
Deel B. microRNAs zijn endogene, niet-coderende, korte RNA moleculen welke post-transcriptioneel genexpressie reguleren, waardoor diverse cellulaire functies gestuurd worden, zoals cellulaire differentiatie, apoptose, oncogenese, metabolisme en endocriene functie. In de humane placenta zijn honderden microRNAs gedetecteerd. Echter, tot dusver is geen van deze microRNAs geassocieerd met placentaire (patho)fysiologie.
Dit hoofdstuk beschrijft de talrijke mechanismen betrokken bij regulatie van genexpressie, zoals aanwezig in alle humane celtypen. Hierna is de steeds belangrijker wordende rol van niet-coderende RNAs als regulerende elementen van genexpressie gepresenteerd. De biogenese en functies van microRNAs worden beschreven, alsook de huidige kennis omtrent hun bijdrage aan placentaire (dys)functie.

Doelstelling van dit proefschrift. In dit proefschrift hebben wij getracht inzicht te krijgen in de pathofysiologische mechanismen en moleculaire profielen van endotheel- en trophoblastceldysfunctie bij ernstige, vroege-ontstane pre-eclampsie. Hiertoe hebben we zowel in vitro als in vivo het optreden en het moleculaire profiel van endotheelceldysfunctie bestudeerd. Tevens hebben we het gedrag van microRNAs en microRNA biogenetische eiwitten bij trophoblast fysiologie en in respons op hypoxie onderzocht.

Hoofdstuk 2
In dit hoofdstuk zijn de effecten van circulerende factoren aanwezig bij ernstige, vroeg-ontstane pre-eclampsie op het endotheliale genexpressie profiel onderzocht. Aangezien circulerende factoren verantwoordelijk worden geacht voor inductie van endotheeldysfunctie bij pre-eclampsie, hypothetiseerden wij dat genen gereguleerd door pre-eclamptische plasma factoren bij zouden kunnen dragen aan endotheeldysfunctie en hierdoor tevens kandidaat targets zouden kunnen zijn voor farmacologische therapieën. Plasmamonsters werden afgenomen van patiënten met ernstige, vroeg-ontstane pre-eclampsie en van gezonde zwangere controle vrouwen. Plasmaspiegels van de von Willebrand Factor (vWF), soluble vascular cell adhesion molecule-1 (sVCAM-1) en C-reactief proteïne waren verhoogd bij patiënten met pre-eclampsie, dat de aanwezigheid van endotheeldysfunctie en inflammatie in vivo impliceert. De expressie van 17,000 genen in primaire humane umbilicale vene endotheelcellen (HUVEC) en humane glomerulaire microvasculaire endotheelcellen (hGMEC) in vitro veranderde niet substantieel na 4, 12 of 24 uur incubatie met plasma van pre-eclamptische patiënten in vergelijking met gezonde zwangere controles, zoals bepaald middels high-throughput transcript profilering. Ook de expressie van VCAM-1, intercellulair cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) en interleukine-6 (IL-6) bleef stabiel na incubatie met pre-eclamptisch plasma, zoals gekwantificeerd middels real-time RT-PCR; dit terwijl de (oplosbare vormen van) deze merkers verhoogd zijn bij pre-eclampsie.
Deze data demonstreren dat oplosbare plasmabestanddelen bij ernstige, vroeg-ontstane pre-eclampsie niet substantieel het endotheliale genexpressie profiel in vitro beïnvloeden. Om deze reden lijkt het waarschijnlijk dat andere mechanismen, in isolatie of in synergie met plasma factoren, betrokken zijn bij inductie van endotheeldysfunctie bij pre-eclampsie.
Het in vitro experimentele systeem van endotheelcelkweken heeft het belangrijke nadeel dat endotheelcellen snel hun orgaanspecifieke gedrag verliezen wanneer ze in een in vitro omgeving worden geplaatst. De niet-pathofysiologische opmaak van de extracellulaire matrix in vitro, de afwezigheid van shear stress en interacties van endotheelcellen met leucocyten en andere bloedbestanddelen beïnvloedt de effecten van pre-eclamptische plasma factoren op endotheelcellen waarschijnlijk substantieel.

Hoofdstuk 3
Vanwege de belangrijke beperkingen van het in vitro experimentele model toegepast in hoofdstuk 2 besloten wij de (dys)functionele eigenschappen van endotheelcellen in verschillende microvasculaire bedden bij ernstige, vroeg-ontstane pre-eclampsie in vivo te onderzoeken. Het wordt aangenomen dat endotheeldysfunctie bij pre-eclampsie een gegeneraliseerd fenomeen is als onderdeel van de maternale multi-systemische inflammatoire respons, echter hiervoor bestaat geen direct bewijs. Om deze reden hebben wij in hoofdstuk 3 het optreden en het moleculaire profiel van pro-inflammatoire endotheelcelactivatie bij patiënten welke lijden aan ernstige, vroeg-ontstane pre-eclampsie onderzocht, in vergelijking met gezonde zwangere vrouwen.
Tijdens sectio caesareae werden biopten genomen van het abdominale vetweefsel, de abdominale fascie en het myometrium van patiënten met ernstige, vroeg-ontstane preeclampsie en van gezonde zwangeren. In deze biopten werd eiwit- en genexpressie van endotheelspecifiek E-selectine, VCAM-1, ICAM-1, endotheline-1, en endotheliaal nitric oxide synthase (eNOS) bepaald, aangezien de producten van deze genen een belangrijke rol spelen bij pro-inflammatoire endotheeldysfunctie en regulatie van de vasotonus. Ook zijn plasmaspiegels van de producten van deze genen verhoogd bij pre-eclampsie, wat suggereert dat de productie van deze endotheelcelspecifieke genen is toegenomen bij pre-eclampsie. In alle bestudeerde weefsels werd echter een stabiele expressie van deze endotheelspecifieke genen gevonden bij pre-eclamptische patiënten, in vergelijking met gezonde zwangeren. Dit terwijl plasmaspiegels van vWF, sVCAM-1 en CRP, merkers van endotheeldysfunctie en inflammatie, bij pre-eclamptische patiënten verhoogd werden gevonden.
Deze resultaten suggereren dat pro-inflammatoire endotheeldysfunctie bij ernstige, vroeg-ontstane pre-eclampsie geen gegeneraliseerd verschijnsel is, maar waarschijnlijk beperkt is tot (orgaanspecifieke) gespecialiseerde vaatbedden. Aangezien het endotheel in verschillende organen en vaatbedden bijzonder heterogeen is wat betreft functie en respons op stimuli, is het mogelijk dat endotheelceldysfunctie bij pre-eclampsie beperkt is tot aangedane organen zoals de nier en de lever. Een grote uitdaging voor toekomstig onderzoek is dan ook de ontwikkeling van nieuwe strategieën welke ons in staat stellen om het moleculaire profiel en de lokalisatie van endotheelceldysfunctie bij pre-eclampsie op te helderen (zie hoofdstuk 5 voor toekomstperspectieven).

Hoofdstuk 4
Placentaire hypoxie na het eerste trimester van de zwangerschap kan resulteren in beschadiging van villeuze trophoblastcellen, een vooraanstaande component in de pathofysiologie van preeclampsie. Hypoxische schade heeft substantiële invloed op het trophoblastaire transcriptoom, en reguleert diverse cellulaire processen, zoals differentiatie, metabole functie, celoverleving en apoptose. Echter, de cellulaire processen geïnduceerde door hypoxie in trophoblastcellen zijn grotendeels onbekend.
Zoals beschreven zijn microRNAs endogene, niet-coderende, korte RNA moleculen welke post-transcriptioneel genexpressie reguleren, waardoor diverse cellulaire functies gestuurd worden, zoals cellulaire differentiatie, apoptose, oncogenese, metabolisme en endocriene functie. Voor de biogenese vanuit microRNA genen en voor de functie van mature microRNAs is een uitgebreide machinerie van eiwitten nodig, de zogenaamde microRNA biogenetische machinerie. Alhoewel diverse microRNAs in de humane placenta zijn gedetecteerd is de rol van microRNAs en hun biogenetische machinerie bij placentaire (dys)functie tot dusver niet onderzocht.
In hoofdstuk 4 hebben wij de expressie van het centrale RNA interference (RNAi) enzym Argonaute-2 (Ago2) en van de gerelateerde microRNA biogenetische eiwitten Drosha, Exportin-5, Dicer en DP103 in humane trophoblastcellen tijdens cellulaire differentiatie en in hypoxische omstandigheden onderzocht. Alle bestudeerde eiwitten kwamen zowel tot expressie in trophoblastcellen geïsoleerd uit humane placentae als in biopten van de humane placenta. In vitro differentiatie van cytotrophoblasten in multinucleaire syncytio-trophoblastcellen had geen effect op de expressie van de microRNA biogenetische eiwitten, een bevinding welke belangrijk is aangezien de mate van expressie van microRNA biogenetische eiwitten de regulerende functies van microRNAs kan beïnvloeden. De microRNA biogenetische eiwitten bleken functioneel en de expressie van honderden microRNAs werd geïdentificeerd in humane trophoblastcellen. Een kleine subset microRNAs bleek gereguleerd door hypoxie, met een verhoogde miR-93 en een verlaagde miR-424 expressie. In tegenstelling hiermee bleef de expressie van microRNA biogenetische machinerie stabiel in hypoxische omstandigheden. Zowel in vitro als in vivo hypoxie had geen invloed op de eiwitexpressie en -lokalisatie van het catalytische RNA-induced silencing complex (RISC) enzym Ago2 en het interacterende eiwit DP103. Ago2 en DP103 co-immunoprecipiteerden, wat impliceert dat deze eiwitten een complex vormen in humane trophoblastcellen, en deze interactie werd niet gemoduleerd door hypoxie. Tenslotte vonden wij dat de overexpressie van de cruciale microRNA maturatie regulator Ago2 het geanticipeerde expressiepatroon van een geselecteerde set trophoblastaire transcripten niet veranderde, wat suggereert dat Ago2 geen limiterende factor is voor de adaptieve respons van trophoblastcellen op hypoxie.
Deze data laten zien dat de belangrijkste microRNA biogenetische eiwitten tot expressie komen in humane trophoblastcellen en honderden microRNAs produceren, zelfs in hypoxische omstandigheden. Hypoxie reguleert de expressie van een kleine subset van microRNAs, waaronder miR-93 en miR-424, welke mogelijk een regulerende rol spelen bij de adaptieve respons van trophoblastcellen op hypoxische stress. De expressie van de belangrijkste microRNA biogenetische eiwitten veranderde niet in hypoxische omstandigheden en is om deze reden niet verantwoordelijk voor de regulatie van bepaalde microRNAs door hypoxie.
De opheldering van microRNA expressie profielen, factoren welke microRNA expressie, biogenese en stabiliteit reguleren, als ook de door microRNA-gemedieerde effecten op cellulair functioneren in normale omstandigheden en bij ziekte zal inzicht verschaffen in de rol van microRNAs bij (dys)functie van trophoblastcellen en pre-eclampsie (zie hoofdstuk 5 voor toekomstperspectieven).

Hoofdstuk 5
In dit hoofstuk zijn de belangrijkste onderzoeksbevindingen en conclusies van dit proefschrift samengevat, bediscussieerd en in het licht geplaatst van de bestaande kennis over de pathofysiologie van preeclampsie.

Hoofdstuk 6
Perspectieven voor toekomstig onderzoek naar endotheel- en trophoblastdysfunctie bij pre-eclampsie worden besproken, met implementatie van nieuwe concepten en technieken. Hiernaast worden toekomstige onderzoeksmogelijkheden naar microRNA functie bij placentaire (dys)functie gepresenteerd.

“